Um aspecto importante do trabalho de um pesquisador é a capacidade de realizar a montagem de uma lâmina histológica/de microscopia para análise de materiais diversos. Independentemente da área de estudos, mas especificamente no domínio da microbiologia, conhecer os protocolos de montagem de lâmina é imprescindível para um aproveitamento adequado dos materiais e da realização de avaliações de qualidade de espécimes.
Neste momento iremos demonstrar como são feitas montagens de lâminas de organismos microscópicos e como observá-los em diferentes aumentos, bem como explicar como um bom pesquisador possui a capacidade de representação das estruturas observadas. Para entender o protocolo a seguir tenha em mente as funcionalidades do microscópio óptico.
MONTAGEM EM LÂMINAS
O material para exame deve ser montado em lâminas de vidro especiais para microscopia e recoberto com lamínula, também de vidro. A lâmina deve estar limpa, sendo um bom critério para avaliar sua limpeza a colocação de uma gota de água sobre a mesma. Se a gota se espalhar, tendendo a ocupar ampla superfície, a lâmina pode ser considerada limpa, caso contrário deve ser novamente lavada. As lâminas podem ser lavadas com detergente e guardadas em álcool 70%.
Seguem os passos para uma boa preparação de lâmina:
- Com uma lâmina em mãos, é necessário colocar uma gota do meio que se deseja estudar sobre ela com o auxílio de um conta-gotas e o material a ser examinado, com um estilete, pinça ou pincel.
- Se necessário, o material pode ser dissociado com ajuda de dois estiletes, observando-se à lupa. A preparação realizada é coberta com uma lamínula, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas de ar pelo encaixe da lamínula em angulação de 45º sobre o líquido.
- O excesso de líquido de montagem, que extravasa pelos bordos da lamínula, deve ser retirado com papel absorvente, evitando-se que a platina do microscópio seja molhada.
- A substituição de um líquido de montagem por outro, por exemplo, um corante, pode ser feita sem a remoção da lamínula. Para isso, coloca-se uma gota do novo líquido na borda da lamínula. Do outro lado da lamínula é necessário encostar um pedaço de papel de filtro que, por capilaridade, irá transferir o líquido antigo para si e moverá o corante para a região da amostra.
- Uma preparação em lâmina pode ser mantida, por curtos períodos, em uma câmara úmida feita com placa de Petri, evitando que a água evapore rapidamente da amostra.
CARACTERÍSTICAS DE UMA BOA MONTAGEM
Uma lâmina corretamente preparada deve apresentar as seguintes características para permitir uma boa observação:
– Ser isenta de bolhas de ar;
– Conter pequena quantidade de material, pois as preparações muito densas impedem a passagem de luz;
– Ter líquido em toda extensão entre lâmina e lamínula;
– A lamínula não estar flutuando (o excesso de líquido pode ser retirado com papel absorvente);
– Nunca haver líquido sob a lâmina;
– A platina do microscópio não ser molhada no processo de montagem.
LÂMINA SOBRE DIFERENTES AUMENTOS
Para visualização e compreensão das lâminas histológicas em diferentes aumentos, é necessário que os alunos entendam que:
(1) cada objetiva possui uma capacidade de ampliação da imagem formada diferente;
(2) cada aumento tem como vantagem a visualização de estruturas menores e com mais clareza em uma determinada área da lâmina;
(3) que cada aumento tem como desvantagem a diminuição do campo de visão geral da lâmina;
Tomemos uma lâmina de um Paramecium sp., preparada com intuitos didáticos, em meio natural e sem adição de corante. Cada objetiva possibilita uma resolução das imagens formadas. Na disciplina se utilizam os aumentos de 40x, 100x e 400x, apesar de existirem situações extra-classe em que aumentos diferentes devem ser empregados. O aspecto geral da lâmina em aumento de 40x deve apresentar algumas informações sobre o organismo e o substrato em que vive, ou não, associado. Tomemos a foto em aumento de 50x, muito próximo da vista em aula.
Figura 1. Aumento de 50x de uma área de lâmina com Paramecium sp.
Quando se pretende obter mais informações sobre os organismos, aumentos maiores devem ser empregados. A utilização do aumento de 100x por exemplo, gerará algumas consequências em relação ao aumento anterior. A primeira consequência é a capacidade de observação de estruturas menores, importante para descrição e identificação dos organismos. A segunda consequência é a diminuição do campo de visão antes obtido pela objetiva anterior.
Figura 2. Aumento de 100x dentro do aumento de 50x.
Observe a imagem em aumento de 100x e a compare com a de 40x. A região enfocada passa a ter mais ênfase e ganha mais detalhamento em relação ao restante da lâmina. A região em cinza é tudo que podia ser visto na imagem anterior, mas que no aumento de 100x não é mais evidenciado.
Figura 3. Detalhe do aumento de 100x.
Note algumas das estruturas apontadas. A estrutura apontada com uma cabeça de seta amarela se trata de uma bolha de ar e é facilmente identificada pelo formato circular com bordas duplas bem delimitadas, uma externa mais escura e uma interna mais clara. Essa estrutura estava clara na imagem anterior? Você diria que ela podem ser melhor diferenciada em qual das duas imagens?
Figura 4. Aumento de 400x dentro do aumento de 100x.
Em um aumento ainda maior fica claro detalhes que antes pareciam invisíveis em aumentos diferentes. Compare a imagem de aumento 100x e de 400x e tente descrever as mudanças observadas, principalmente no reconhecimento das estruturas celulares do Paramecium.
Figura 5. Detalhe de um dos aumentos de 400x.
Figura 6. Detalhe de outro aumento de 400x.
Observado separadamente cada detalhe, na figura 5, a cabeça de seta amarela representam os tricocistos secretados que auxiliam na defesa do organismo; ao passo que a cabeça de seta vermelha é uma estrutura não identificada, possivelmente conteúdo citoplasmático de outro Paramecium que morreu durante a montagem da lâmina. Na figura 6, por sua vez, é possível identificar os cílios do Paramecium apresentado, pela cabeça de seta amarela, e a estrutura da bolha em uma definição melhor, pela cabeça de seta vermelha.
REPRESENTAÇÃO GRÁFICA
Em nossas aulas práticas, não será empregada a objetiva de maior aumento (de imersão) porque ela requer o uso de óleo de imersão e oferece uma resolução não muito superior à objetiva de aumento médio.
A representação de organismos microscópicos (e organismos em geral) requer cuidadosa seleção de partes e estruturas específicas para serem documentadas. Geralmente se inicia pelo aspecto geral, em observação macroscópica, depois em lupa e finalmente ao microscópio. Neste último, se inicia com a objetiva de menor aumento, passando para aumentos maiores conforme o que se pretende observar.
Uma boa ilustração vem acompanhada de legendas claras e bem pensadas, contendo o aumento a qual a ilustração foi baseada, indicações das estruturas apontadas corretamente sobre a extremidade das mesmas, traços bem visíveis e, quando necessário, cores representativas para diferenciar estruturas diferentes e que não se misturem com a ilustração em si.
No final das aulas, é importante verificar se os aparelhos ópticos e as bancadas estão em ordem e limpos, sendo um dever de cada aluno manter o espaço de aulas práticas devidamente organizado.