Neste experimento, os alunos irão determinar a concentração de células presentes em fermento biológico utilizando técnicas de microbiologia e cálculos matemáticos. A atividade envolve a preparação de suspensões celulares, diluições seriadas e contagem de colônias em placas de Petri. A partir dos resultados obtidos, será possível calcular a concentração celular tanto na suspensão quanto no fermento biológico original, integrando conceitos de potência, proporção, volume e análise quantitativa.
Materiais e Equipamentos
- 100 mg de fermento biológico
- Placas de Petri com meio de cultura YPD
- Microtubos
- Caixa de ponteiras
- Estante para microtubos
- Alças de Drigalski
- Tubo Falcon
- Micropipetas
- Caneta permanente
- Solução salina 0,9%
Procedimento Experimental
- Lave as mãos com sabonete ou detergente.
- Cada grupo receberá 7 microtubos (6 contendo 900 µl de solução salina e 1 contendo 0,1 g de fermento biológico), 3 placas de Petri contendo meio YPD, 1 tubo Falcon contendo 10 ml de suspensão salina, 3 alças de Drigalski, uma estante, uma micropipeta, uma caixa com ponteiras e 1 caneta colorida. Lembre-se de que o interior dos microtubos, das placas de Petri, do tubo Falcon, as ponteiras e as alças de Drigalski são estéreis e devem permanecer fechados ou embalados até o momento do uso.
- Na superfície das placas de Petri (na face de menor diâmetro), identifique, utilizando uma caneta, o número do grupo e a diluição correspondente ao plaqueamento de cada placa: 10−4, 10−5 e 10−6.
- Na parte fosca dos microtubos, identifique com uma caneta a diluição correspondente a cada tubo (10−1, 10−2, 10−3, 10−4, 10−5 e 10−6). Em seguida, organize-os em uma única fileira na estante.
- Transfira todo o conteúdo do microtubo contendo o fermento para o tubo Falcon.
- Homogeneíze a suspensão invertendo cuidadosamente o tubo Falcon de 4 a 5 vezes.
- Abra o tubo Falcon utilizando o dedo mindinho para segurar a tampa, evitando tocar na borda estéril. Introduza uma ponteira estéril na suspensão, aspire 100 µl e feche novamente o tubo.
- Transfira os 100 µl para o microtubo identificado como 10−1. Feche imediatamente o tubo, mova-o para outra fileira da estante e descarte a ponteira utilizada.
- Para preparar as demais diluições, homogeneíze o microtubo anterior invertendo-o de 3 a 4 vezes. Utilize uma nova ponteira, aspire 100 µl da suspensão e transfira o volume para o microtubo seguinte, repetindo o procedimento sucessivamente até a diluição 10−6.
- Inicie o plaqueamento pela diluição 10−6. Homogeneíze o microtubo, aspire 100 µl e deposite cuidadosamente o volume sobre o meio de cultura da placa correspondente. Não encoste a ponteira na superfície do meio. Mantenha a placa fechada, abrindo apenas o suficiente (30° a 45°) para adicionar a suspensão e fechando-a imediatamente em seguida.
- Utilizando uma alça de Drigalski, espalhe delicadamente a suspensão sobre toda a superfície do meio de cultura com movimentos circulares, sem exercer pressão excessiva. Continue até que todo o líquido seja absorvido.
- Repita os dois passos anteriores para as diluições 10−5 e 10−4, obtendo ao final três placas correspondentes às diluições 10−4, 10−5 e 10−6.
- Incube as placas invertidas (com a tampa voltada para baixo) em estufa a 37 °C ou em temperatura ambiente até que sejam observadas colônias com aproximadamente 1 a 2 mm de diâmetro.
- Na aula seguinte, conte as colônias presentes em cada placa utilizando uma caneta para auxiliar na marcação durante a contagem.