Neste experimento, os alunos aprofundam os conceitos desenvolvidos anteriormente ao calcular a concentração celular de colônias individuais de Saccharomyces cerevisiae. A atividade integra matemática e microbiologia por meio de diluições seriadas, cálculos de área, volume, potência e análise de dados experimentais. Além disso, os estudantes medem o diâmetro das colônias e relacionam essas medidas com a concentração celular, construindo interpretações gráficas a partir dos resultados obtidos no laboratório.
Materiais e Equipamentos
- Placas de Petri com meio YPD
- Microtubos
- Micropipeta
- Ponteiras
- Estante
- Alça de Drigalski
- Colherzinha de plástico
- Régua
- Caneta permanente
- Pedaço circular de EVA
- Solução salina 0,9%
Procedimento Experimental
- Cada grupo receberá 1 placa de meio contendo colônias isoladas de S. cerevisiae ou utilizará 1 ou mais placas do Experimento 1.
- Selecione 3 colônias bem isoladas, ou seja, sem outras colônias muito próximas. Preferencialmente, escolha colônias de diâmetros diferentes e utilize uma caneta para desenhar um quadrado ao redor de cada uma. IMPORTANTE: Não desenhe o quadrado muito rente à colônia.
- Identifique as colônias escrevendo ao lado de cada quadrado marcado: C1, C2 e C3.
- Coloque a placa com as colônias marcadas sobre o círculo de EVA. Posicione uma régua próxima à placa e fotografe o conjunto placa+régua.
- Veja na seção Medir colônias como medir o diâmetro da colônia na fotografia.
- Com o diâmetro da colônia calculado, defina qual diluição será usada para cada colônia com base na tabela abaixo.
- Na lateral dos microtubos contendo 0,9 ml de solução salina, na parte fosca, indique a diluição que será feita em cada microtubo (10−1, 10−2, 10−3 ou 10−4). Há 3 microtubos, contendo 1 ml de salina cada, que foram pré-marcados como C1, C2 e C3. Acomode-os na estante de microtubos, todos na mesma fileira.
- Com o auxílio de uma colherzinha de plástico, retire a colônia demarcada no passo 2 e transfira-a para o microtubo C1.
- Agite bem o microtubo, até que a colônia se desfaça por completo. Isso pode ser observado pelo aumento da turbidez da suspensão. Atenção: o ágar não irá se desfazer por completo, restando pequenos pedaços de ágar na suspensão.
- Com o auxílio de uma micropipeta, insira a ponteira na suspensão de leveduras, puxe delicadamente 100 µl e feche o microtubo. Atenção: cuidado para não coletar pedaços de ágar.
- Transfira os 100 µl para o microtubo de diluição 10−1 e feche a tampa do microtubo rapidamente. Após depositar o conteúdo da micropipeta no microtubo, mude-o para a fileira da frente (ou de trás) da estante. Descarte a ponteira.
- Para as seguintes diluições, HOMOGENIZE a suspensão contendo a diluição 10−1 e transfira 100 µl para o próximo microtubo na sequência de diluições. Repita o processo de diluições até transferir para o último microtubo. Lembre que a diluição final será 10−2, 10−3 ou 10−4.
- Plaqueamento das diluições: Homogenize bem os microtubos, aspire 100 µl da diluição final e deposite sobre o meio de cultura nas placas de Petri marcada com C1.
- Com o auxílio da alça de Drigalski, espalhe o líquido delicadamente sobre o meio de cultura. IMPORTANTE: Espalhe até secar.
- Repita o processo de retirada, suspensão, diluição e plaqueamento das colônias C2 e C3.
- Deixe as placas com a tampa invertida e incube na estufa a 37◦C até que surjam colônias com pelo menos 1–2 mm de diâmetro (geralmente em até 36 h).
- Na aula seguinte, conte as colônias em cada uma das placas.