Financiamento

Dados do financiamento

Células pluripotentes têm o potencial de se diferenciar em todos os tipos celulares de um organismo e a compreensão dos mecanismos que governam o status de pluripotência é crucial para a medicina regenerativa. Evidências indicam o envolvimento do mecanismo de proteostase, regulado pela proteína induzida por choque térmico / proteína indutível ao estresse 1 (STIP1) e seus ligantes, Hsp70 e Hsp90, na embriogênese e manutenção da pluripotência de células-tronco embrionárias (CTEs). Resultados promissores de um projeto de pesquisa, iniciado em um período sabático pela Dr. Lopes na University of Western Ontario, demonstram a capacidade do STIP1 na regulação dos principais fatores de pluripotência de células-tronco. Com base nesses resultados preliminares, um componente crítico para esses esforços colaborativos é a geração de vários modelos de camundongos almejando o gene STIP1. O grupo do Dr. Prado foi pioneiro no estudo da função do STIP1 na embriogênese de mamíferos in vivo. Além disso, seu grupo recentemente demonstrou que a deleção de STIPI em camundongos é letal para o embrião, o que sugere que o STIP1 é um fator essencial no estágio inicial do desenvolvimento embrionário. Várias linhagens de camundongos transgênicos para STIP1, expressando diferentes níveis de STIP1, estão disponíveis e pesquisadores da Western são o único grupo no mundo a manter a nova linhagem STIP1”TPR1 gerada (expressando a isoforma truncada do STIP1). Essas linhagens de animais transgênicos são fundamentais para nossa proposta a qual visa compreender como o STIP1 e seus parceiros regulam a proteostase em células-tronco pluripotentes. Nossa hipótese é que o STIP1 é um regulador chave da maquinaria de chaperonas Hsp90 e Hsp70 durante o desenvolvimento mediando a autorrenovação e a diferenciação de CTEs. Os nossos principais objectivos são: i) determinar se STIP1 regula os níveis de clientes e co-chaperonas necessários para o desenvolvimento embrionário; ii) Determinar se as alterações nos níveis STIP1 regulam a autorrenovação e a pluripotência de CTEs; iii) Determinar os mecanismos pelos quais o aumento e / ou diminuição dos níveis de STIP1 regulam a resiliência das células-tronco embrionárias. Para atingir esses objetivos, CTEs derivadas de blastocistos de camundongos transgênicos que expressam diferentes níveis de STIP1, serão usadas para ensaios de proliferação celular, diferenciação, sobrevivência, autorrenovação e formação de corpos embrioides. Essa colaboração permitirá que o Dr. Lopes continue a se beneficiar da participação em um ambiente de pesquisa com um grupo consolidado que contribuirá para estabelecer novas colaborações com potencial impacto nos Programas de Pós-graduação de ambas as instituições, com visitas curtas de jovens estudantes e bolsistas a centros de pesquisa para desenvolver pesquisas avançadas.

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Glioblastoma (GBM), a forma mais agressiva e frequente de tumores malignos cerebrais em adultos, contém uma subpopulação de células tumorais, denominadas células-tronco de GBM (CTGs), essenciais para manutenção do tumor, invasão e resistência à terapia. Marcadores de membrana plasmática de CTGs funcionalmente relevantes apresentam potencial como alvo terapêutico para tratamento dessa doença agressiva. Nosso grupo tem mostrado que a glicoproteína de membrana GPI-ancorada, proteína prion celular (PrPC) está enriquecida em CTGs e é co-expressa com marcadores convencionais de CTGs. A perda-de-função de PrPC em CTGs resulta na inibição da autorrenovação, proliferação e capacidade de formação de tumores. Propõe-se que PrPC atue como proteína scaffold na superfície celular, recrutando e organizando moléculas em plataformas de sinalização com diferentes consequências biológicas. Diante desses achados, este estudo visa investigar o papel de PrPC como molécula chave na autorrenovação e diferenciação de CTGs através da modulação de plataformas de sinalização de vias associadas ao stemness e como alvo para terapia de GBM. O objetivo será contemplado utilizando quatro paradigmas: 1) ensaios in vitro utilizando culturas primárias de células- tronco de GBM derivadas de pacientes para testar a função de PrPC e seus ligantes na biologia dessas células; 2) Análise do transcriptoma de GSCs através de microarranjos de exons e sequenciamento de RNA para definir o padrão de expressão de PrPC e seus parceiros, seus alvos e vias de sinalização positiva e negativamente reguladas; 3) Ensaios in vivo utilizando CTGs para alvejar PrPC, seus alvos e vias de sinalização relacionadas em combinação com temozolomida 4) Ensaios in vitro para testar os efeitos de vesículas extracelulares na aquisição de fenótipo neuronal em CTGs como terapia alternativa anti-GBM. Dessa forma, pretende-se utilizar o conceito scaffold de PrPC como uma alternativa para o desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento do glioblastoma, além de demonstrar que PrPC pode atuar como um regulador chave na manutenção de stemness de CTG.

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A co-chaperonina STI1 (‘stress inducible protein one’) foi caracterizada pelo nosso grupo como ligante específico da proteína prion celular (PrPC), a isoforma normal da proteína relacionada à doenças neurodegenerativas. A interação ente PrPC e STI1 é capaz de modular a sobrevivência e diferenciação neuronais. Além disso, PrPC desempenha uma função importante na biologia de células tronco neurais (NSCs) e dados preliminares do nosso grupo mostram que sua interação com STI1 participa na auto-renovação (expansão e manutenção) destas células. As NSCs além de estarem envolvidas com a neurogênese do sistema nervoso central adulto, podem originar ou controlar neoplasias cerebrais, particularmente gliomas, meduloblastomas e ependimonas. Sabe-se que STI1 é secretada tanto por astrócitos normais quanto tumorais (linhagens de glioblastoma) e sua interação com PrPC modula a proliferação celular de glioblastoma humano. Interessantemente, estudos recentes in vivo mostram que as NSCs podem ser recrutadas para xenotransplantes de glioblastoma e que este evento está associado com redução do tamanho do tumor e ao aumento da sobrevida dos animais. Diante desses dados torna-se aparente um possível envolvimento de STI1 na biologia de tumores cerebrais, uma vez que o bloqueio de sua interação com PrPC e sua participação na auto-renovação de NSCs poderiam modular a progressão tumoral. Considerando-se que as NSCs constituem um modelo relevante para explorar a biologia de gliomas e para a triagem de novos agentes terapêuticos, esse projeto tem como objetivo investigar a participação de STI1 e PrPC na biologia de células tronco neurais de animais adultos e estudar uma possível relação entre essas células com neoplasias cerebrais. Finalmente, cabe ainda ressaltar que a concretização desse projeto implantaria novas linhas de pesquisa no grupo: neurogênese, estudos de neoplasias associadas ao SNC (i.e, glioblastomas) e a relação entre neurogênese e tumorigênese cerebral.

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Stress inducible protein 1 foi originalmente identificada como uma co-chaperonina capaz de modular a atividade de proteínas de choque térmico (Hsps) de 70 e 90 kDa. No entanto, um grande número de evidências sugere que STI1 não é apenas uma proteína adaptadora para manter Hsps unidas. A interação de STI1 com inúmeros parceiros como membros da família Hsps, fatores de transcrição, proteína prion (PrPC) entre outros, mostra sua versatilidade funcional. As diversas localizações subcelulares de STI1 indicam que essa proteína pode formar complexos multiprotéicos no núcleo, citoplasma e no meio extracelular, com diferentes atividades biológicas. Interessantemente, quando no espaço extracelular, a forma solúvel de STI1 é capaz de interagir com PrPC, uma glicoproteína de membrana plasmática, e orquestrar importantes fenômenos biológicos relacionados ao desenvolvimento do sistema nervoso e plasticidade neural, como auto-renovação de progenitores neurais, controle de diferenciação e sobrevivência neurais e consolidação da memória. Recentes achados mostram STI1 envolvida na regulação do status pluripotente de células-tronco embrionárias, sugerindo um papel para essa molécula na embriogênese. Diante desses dados que mostram inúmeras funções biológicas associadas a STI1, e na tentativa de explorar o papel de STI1 no desenvolvimento de mamíferos, um camundongo nocaute constitutivo, deficiente para o gene de STI1, foi gerado. Dados preliminares mostram que animais em homozigose a deleção de STI1 é letal e leva à má-formação embrionária que parece ocorrer entre o sexto e o décimo dia do desenvolvimento murino (E6.5 – E10.5), indicando assim que STI1 pode ser um fator indispensável no desenvolvimento de mamíferos. Desta forma, o cultivo de células-tronco embrionárias pluripotentes torna-se a abordagem mais adequada para estudarmos o mecanismo envolvido na letalidade de embriões deficientes para STI1 no período inicial do desenvolvimento, pois é o único modelo que mimetiza o desenvolvimento do epiblasto in vitro com capacidade de contribuir para todas as células do tecido fetal, incluindo linhagem germinativa. Considerando-se que pouco se conhece a respeito da contribuição de STI1 para a manutenção de células-tronco embrionárias e desenvolvimento embrionário, e baseando-se nos dados da literatura que mostram um papel central de STI1 em mecanismos que governam a plasticidade cerebral durante o desenvolvimento, o principal objetivo desta proposta é investigar a função de STI1 no desenvolvimento embrionário murino utilizando como modelo células-tronco embrionárias e avaliar a relevância do seu principal parceiro, PrPC, nestes processos. Portanto, esse estudo contribuirá para a elucidação das propriedades tróficas de STI1 sobre os mecanismos moleculares que regulam a proliferação e/ou a diferenciação de CTEs, acarretando na potencial aplicação desta molécula como uma ferramenta terapêutica na medicina regenerativa.

Dados do financiamento

Glioblastoma (GBM), a forma mais agressiva e frequente de tumores malignos cerebrais em adultos, contém uma subpopulação de células tumorais, denominadas células-tronco de GBM (CTG), essenciais para manutenção do tumor, metástase e resistência à terapia. Marcadores de membrana plasmática de CTG funcionalmente relevantes apresentam potencial como alvo terapêutico para tratamento dessa doença agressiva. Nosso grupo tem mostrado que a glicoproteína de membrana GPI-ancorada, proteína prion (PrPC) está enriquecida em CTG e é co-expressa com marcadores convencionais de CTG, como CD133. A perda-de-função de PrPC em CTG resulta na inibição da autorrenovação, proliferação e capacidade de formação de tumores. Vários ligantes já foram descritos para PrPC, incluindo proteínas da matriz extracelular e transmembrana, das quais algumas são funcionalmente relevantes para a biologia de CTG. Dos principais marcadores de CTG já descritos, CD133, CD44 e integrinas ±6 e ±7, interagem e/ou compartilham com PrPC o mesmo microdomínio de membrana, sendo preferencialmente localizados em lipid rafts. Propõe-se que PrPC atue como proteína scaffold na superfície celular, recrutando e organizando moléculas em plataformas de sinalização com diferentes consequências biológicas. Diante desses achados, este estudo visa investigar o papel de PrPC como molécula chave na manutenção do estado indiferenciado de CTG através da modulação de plataformas de sinalização de vias associadas ao stemness e como alvo para terapia de GBM. Para esse fim, estudos de perda-de-função de PrPC serão conduzidos pela técnica de CRISPR/Cas9 em CTG. A expressão, distribuição na superfície celular e tráfego intracelular de potenciais moléculas componentes da plataforma serão abordadas por imunofenotipagem, ensaios bioquímicos, microscopia confocal e ensaios funcionais de autorrenovação e proliferação. A participação de PrPC e seus parceiros, membros da plataforma de sinalização, também será avaliada em ensaios de resistência à quimioterápico (temozolomida). Dessa forma, pretende-se utilizar o conceito scaffold de PrPC como uma alternativa para o desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento do glioblastoma, além de demonstrar que PrPC pode atuar como um regulador chave da manutenção de stemness de CTG.