- Descrição do equipamento
A plataforma de Espectrometria de Massas da facility GlycoProteomics and Structural Mass Spectrometry (GPS-MS) é constituída por dois espectrômetros de massas:
1. Thermo Scientific Orbitrap AscendTM acoplado ao sistema de cromatografia líquida Thermo Scientific Vanquish Neo, sendo configurada para análise de modificações pós-traducionais (PTMs) e caracterização estrutural de proteínas. O espectrômetro de massas inclui os seguintes componentes: 1) Fonte NanoESI Proxeon EASY-Spray, 2) Fonte de íons interna EASY-ETD (Electron-Transfer Dissociation), 3) Interface FAIMS Pro Duo (High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry) e 4) Opção High Mass Range.
2. Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240TM acoplado com o sistema de cromatografia líquida Thermo Scientific Vanquish Flex, sendo configurada para análise bottom-up and top-down com a Opção Extended Mass Range. O Orbitrap Exploris 240™ é um espectrômetro de massas versátil, configurado para abordagens de proteômica bottom-up e top-down, acoplado ao sistema UHPLC Vanquish Flex para separações cromatográficas robustas e reprodutíveis. Este sistema é otimizado para análises de amplo espectro, desde peptídeos derivados de digestão enzimática até proteínas intactas, graças à opção Extended Mass Range, que permite a detecção de íons de alta massa com precisão. A resolução de até 240.000 (em m/z 200) e alta velocidade de aquisição facilitam a identificação de espécies em misturas complexas. A flexibilidade de ionização, compatível com ESI (eletrospray) e APCI (ionização química à pressão atmosférica), torna o sistema adequado para diversas aplicações. A combinação com o Vanquish Flex assegura gradientes precisos e baixa dispersão, essenciais para análises quantitativas e de alta profundidade.
Ambos os sistemas operam com software Thermo Scientific™ (Proteome Discoverer, Xcalibur), permitindo processamento avançado de dados, incluindo identificação de PTMs (Post-Translational Modifications), quantificação label-free e análise estrutural. Enquanto o Orbitrap Ascend™ se destaca em estudos de modificações pós-traducionais e mobilidade iônica (FAIMS), o Orbitrap Exploris 240™ oferece maior versatilidade para proteômica. Esta configuração é ideal para análises que demandam alta precisão, sensibilidade e capacidade de análise estrutural, cobrindo desde a descoberta de biomarcadores até a caracterização de bioterapêuticos.
2. Localização do equipamento
A plataforma está alocada fisicamente na facilty GlycoProteomics and Structural Mass Spectrometry (GPS-MS) do Depto. de Parasitologia, Instituto de Ciências Biomédicas USP, Av. Prof. Lineu Prestes, 1374, Ed. Biomédicas 2, sala 48, sob supervisão do Prof. Dr. Giuseppe Palmisano. O uso da plataforma será gerenciado por um sistema de agendamento online por meio da plataforma CEFAP-PLUMA, sendo necessária a submissão do formulário de agendamento com as informações sobre o tipo e processamento das amostras (formulário em anexo).
Comitê Gestor e Comitê de Usuários
Comitê Gestor
O Comitê Gestor é responsável pelo equipamento, garantindo seu bom funcionamento e acesso aos usuários internos e externos à comunidade USP. O comitê gestor é responsável pela instalação, controle de acesso e alocação de tempo de uso. Para esse equipamento o seguinte comitê gestor é composto pelo pesquisador responsável pelo projeto e os três pesquisadores associados:
Titulares:
Prof. Dr. Giuseppe Palmisano – Depto. Parasitologia – ICB-USP
Prof. Dr. Fábio C. Gozzo – Instituto de Química – Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Profa. Dra. Suely Kazue Nagahashi Marie – Faculdade de Medicina – USP
Dra Claudia Blanes Angeli – Depto. Parasitologia – ICB-USP
Suplente
Prof. Dr. Gustavo H. Goldmann – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo (USP)
Comitê de Usuários
O Comitê de Usuários é formado por membros que de fato utilizam o equipamento. O comitê tem a função de ouvir os usuários, garantindo suas demandas frente ao uso do equipamento, levando críticas e sugestões ao Comitê Gestor e, eventualmentepodendo levar essas críticas ao conhecimento da Diretoria do ICB – USP.
Titulares:
Prof. Dr. Claudio R. F. Marinho – ICB-USP, Depto. de Parasitologia
Prof. Dr. Fernando R.de Moraes Abdulkader – ICB-USP, Depto de Fisiologia e Biofísica
Profa. Dra. Maria Lucia Cardillo Corrêa Giannella – Faculdade de Medicina (FM), USP
Suplente:
Dra. Sueli Mieko Oba Shinjo – Faculdade de Medicina – USP
Critérios para Uso do Equipamento
O acesso à plataforma será regulado de acordo com as seguintes diretrizes:
- A Dra. Claudia B. Angeli, especialista de laboratório, um técnico de nível TT-5 e um técnico de nível TT-4 serão responsáveis pela operação diária do equipamento.
- Os equipamentos estão disponíveis para usuários da USP e usuários externos, mediante agendamento.
- Somente o pessoal técnico treinado, incluindo superusuários, terão permissão para operar os equipamentos.
- Todos os usuários deverão assinar um termo de compromisso, concordando em seguir as diretrizes de uso do equipamento.
- Após cada uso, os técnicos deverão preencher o livro de registro e reportar quaisquer problemas.
Agendamento dos equipamentos da plataforma GPS-MS
O agendamento é realizado em 4 etapas, listadas abaixo:
1. Preenchimento do formulário, no site https://sites.usp.br/proteomics/, DOWNLOAD DO FORMULÁRIO DE AGENDAMENTO
2. Envio do formulário para gpsms@icb.usp.br e aguarde a confirmação do recebimento e o valor a ser pago pelo serviço solicitado
3. Efetuar o pagamento referente ao valor das análises solicitadas e enviar o comprovante para gpsms@icb.usp.br
4. Aguarde o recebimento da confirmação e data de entrega das amostras.
Identificação de proteínas: As análises de identificação de proteínas serão realizadas em fluxo contínuo. Os formulários enviados pelos usuários serão avaliados e caso a proposta seja aceita, as amostras deverão ser entregues na data combinada. Para a entrega dos resultados será fornecida a lista de proteínas identificadas, através da busca em banco de dados, junto com um documento contendo as informações referentes aos parâmetros de análise. Os resultados referentes à análise de proteoma total incluirão uma análise de quantificação comparativa entre as diferentes amostras (controle x experimentais) utilizando software específico. O usuário poderá solicitar a aquisição com método DDA ou DIA. O utilizo de outros softwares, análises especificas, ou quaisquer informações adicionais serão cobradas separadamente.
Resultados de identificação de proteínas:
Dados DDA: para a identificação e quantificação de proteínas realizamos a busca em bancos de dados de proteínas (NCBInr -http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ e Uniprot – http://www.uniprot.org/) através do software Proteome Discovery versão 1.4 (Thermo Scientific) utilizando a ferramenta de busca SEQUEST (http://fields.scripps.edu/sequest/), que correlaciona os espectros de MS2 de peptídeos composto por sequência de aminoácidos com as sequências depositadas nos respectivos bancos.
Dados DIA: para a identificação e quantificação de proteínas realizamos a busca em bancos de dados de proteínas utilizando o software DIANN.
Armazenamento de dados pós análise
Os dados brutos serão enviados após a análise, por link do GoogleDrive e devem ser baixados no prazo de uma semana. Os usuários são responsáveis pelo seu armazenamento dos dados brutos, que muitas vezes são solicitados nas publicações. Uma vez que temos uma limitação no armazenamento, tanto fisicamente como em nuvem, armazenaremos os arquivos de extensão .RAW até um ano após a data da análise. Passado um ano os dados serão permanentemente apagados.
Preparo de amostras de Bandas de Gel e Proteína em Solução
Não realizamos a digestão de amostras de Bandas de Gel e Proteína em Solução. O preparo de amostra é responsabilidade do próprio usuário. Abaixo disponibilizamos alguns protocolos para extração, digestão e dessalinização dessas amostras a serem enviadas. O planejamento de protocolos específicos poderá ser efetuado em conjunto com a equipe da facilidade GPS-MS.
Ainda, para aqueles usuários que não conseguirem fazer a dessalinização das amostras, forneceremos esse serviço mediante o acréscimo de R$ 40 por amostra*.
Atenção: No processo de lise celular e de tecidos, extração de proteínas e reações de imunoprecipitação, muitas vezes são utilizados reagentes incompatíveis com a técnica de espectrometria de massas, tais como Chaps, Triton, PEG, NP-40, SDS, entre outros detergentes. Esses reagentes, além de causarem danos ao equipamento, suprimem o sinal analítico, ligam-se de forma permanente à coluna cromatográfica, contaminando todo o sistema. Para qualquer análise é necessário especificar os tampões utilizados nos protocolos de extração de proteínas, imunoprecipitação e digestão. Em caso de amostras mal digeridas e/ou contendo contaminantes que danifiquem o sistema, o usuário deverá arcar com os custos de aquisição de uma nova coluna e pre-coluna cromatográfica.